Test Antiossidanti
OxyLAB | UNIVPM
Cosa sono
I test antiossidanti sono metodologie utilizzate in ambiti diversi, ma con alcune sovrapposizioni e collegamenti, specialmente quando si tratta di valutare prodotti o sostanze per il loro impatto sulla salute e sul benessere. Ecco alcuni punti in comune:
Valutazione degli effetti benefici sulla salute, prevenzione dello stress ossidativo, metodi di misurazione, ricerca scientifica e focus sulla salute e sul benessere.
In sintesi, mentre i test di efficacia e i test antiossidanti possono avere scopi specifici, ci sono sovrapposizioni nella loro applicazione quando si tratta di valutare prodotti per la salute umana. Entrambi cercano di fornire dati scientifici che possano supportare le affermazioni relative ai benefici per la salute di determinate sostanze o prodotti.
L’attività antiossidante può essere studiata valutando l’espressione di attività enzimatiche antiossidanti (SOD, CAT, GST, GPX, ecc.) e il potenziale redox (GSH/GSSG).
Test antiossidanti e di bilanciamento redox
Rilevamento delle specie reattive dell’ossigeno
La valutazione dei livelli intracellulari di specie reattive dell’ossigeno (ROS), associate a disfunzioni metaboliche, viene eseguita utilizzando la sonda fluorescente carbossi-2,7-diclorofluoresceina diacetate (carbossi-H2 DCFDA) e successiva analisi mediante saggio citofluorimetrico.
In breve, le cellule vengono incubate con il tampone fosfato salino addizionato al carbossi-H2 DCFDA nel bagnetto termostatico a 37°C protetti dalla luce. Successivamente, viene effettuata la colorazione con propidio ioduro. I dati di fluorescenza vengono registrati mediante citofluorimetro e le cellule positive al propidio ioduro vengono escluse dalle successive analisi.
Saggio ORAC di valutazione della capacità antiossidante
La capacità antiossidante totale viene valutata attraverso il saggio ORAC che sfrutta la capacità di assorbanza dei radicali liberi. Tale saggio misura il decadimento in termini di fluorescenza della fluoresceina a seguito dell’incubazione con 2,2’-azobis (2-metilpropionamidine) diidrocloride (AAPH).
La soluzione contenente fluoresceina viene aggiunta all’estratto cellulare. Dopo aver aggiunto l’AAPH, il decadimento di fluorescenza viene valutato ad intervalli di 5 minuti per 3 ore ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 485 nm e di emissione di 530 nm, utilizzando un lettore di micropiastre. La quantificazione della capacità cellulare antiossidante totale viene effettuata considerando l’area sottostante il segnale di fluorescenza rispetto alla curva del tempo.
Quantificazione del glutatione totale
Il glutatione è il principale tiolo non proteico intracellulare, coinvolto nella protezione di cellule e tessuti dal danno ossidativo. Può essere in forma ridotta (GSH) o ossidata (GSSG). Il glutatione totale viene quantificato mediante saggio di riciclaggio della glutatione reduttasi (GR) in presenza di 5,5-ditiobis (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB).
Nel dettaglio, il GSH, reagendo con il DTNB, produce l’acido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB) e il GSTNB, il quale viene ridotto dalla GR per riciclare GSH e produrre altro TNB. Il GSH viene anche ossidato a GSSG dalla glutatione perossidasi (GPX), e a sua volta il GSSG viene ridotto a GSH dalla GR, consentendo così la misurazione dei livelli di glutatione totale. Tale quantificazione viene effettuata mediante misurazione dell’assorbanza a 412 nm con lettore di micropiastre.
Valutazione attività degli enzimi antiossidanti
L’attività degli enzimi antiossidanti glutatione reduttasi (GR), glutatione perossidasi (GPX), glutatione S-transferasi (GST), catalasi (CAT) e superossido dismutasi (SOD) viene valutata mediante lettore di micropiastre.
L’attività della GR, una flavoproteina che catalizza la riduzione dipendente dal NADPH del GSSG a GSH, viene monitorata quantificando la riduzione del segnale di assorbanza a 340 nm a fronte dell’ossidazione del NADPH nel processo di riduzione del GSSG.
La GPX catalizza la riduzione degli idroperossidi mediante il GSH al fine di proteggere le cellule dal danno ossidativo. L’attività della GPX viene quantificata mediante una reazione accoppiata con la GR ed utilizzando l’idroperossido di cumene come substrato. In questo saggio il GSSG, prodotto dalla GPX, viene riciclato a GSH da GR e NADPH. La riduzione dell’assorbanza del NADPH viene misurata a 340 nm.
Il GST è un enzima multifunzionale che svolge un ruolo cruciale nella detossificazione cellulare mediante la coniugazione di molecole tossiche al glutatione. L’aumento di assorbanza a seguito della coniugazione dell’1-cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) con il GSH viene valutato a 340 nm.
La CAT è un enzima antiossidante implicato nella detossificazione dal perossido di idrogeno (H2O2). L’attività della CAT viene monitorata usando H2O2 come substrato e la riduzione di assorbanza, associata al consumo di H2O2 , viene misurata a 240 nm.
La SOD catalizza la dismutazione dell’anione superossido ad ossigeno e H2O2. Nel saggio enzimatico i radicali superossido ottenuti dalla xantina ossidasi ed ipoxantina vengono rilevati dal sale di tetrazolio. L’attività della SOD viene quantificata registrando l’assorbanza a 440-460 nm.
Altri servizi
Test di Citotossicità
Test di Efficacia
