Test di Citotossicità
I test di citotossicità “in vitro” utilizzano colture cellulari in condizioni ottimali per simulare un ambiente biologico. Attraverso questi studi, è possibile valutare il grado di citotossicità di un composto e stimarne gli effetti sulle cellule, fornendo indicazioni sulla sua potenziale tossicità per l’organismo umano. Il composto da testare viene aggiunto alle cellule in diverse concentrazioni per determinare una possibile relazione dose-risposta. Dopo un periodo di incubazione, gli effetti del composto sulle cellule vengono analizzati attraverso saggi specifici. I risultati vengono elaborati utilizzando software specifici per l’ottenimento di un quadro dettagliato sulla tossicità del composto.
I test “in vitro” sono considerati un’alternativa etica e altamente controllata per valutare la citotossicità, riducendo la dipendenza da modelli complessi. Offrono risultati rapidi, riproducibili e affidabili, consentendo di ottenere dati precisi per la sicurezza e lo sviluppo dei prodotti.
Test di vitalità cellulare
DETERMINAZIONE DELLA CURVA DI CRESCITA
La cinetica della crescita cellulare è rappresentata dalla curva di crescita, ottenuta coltivando le cellule su adeguati supporti e monitorando nel tempo le variazioni nel loro numero. La conta cellulare viene eseguita a diversi time-point utilizzando il colorante Trypan Blue, che consente di distinguere le cellule vive, che escludono il colorante, da quelle morte, che lo assorbono. Questo approccio permette di valutare la vitalità cellulare e di tracciare con precisione la curva di crescita. I dati raccolti per ciascun tempo e per ogni concentrazione del composto in esame consentono di determinare parametri chiave come IC50, GI50 e LD50, fondamentali per la caratterizzazione della citotossicità.
Nel dettaglio, consiste nel distacco delle cellule dal supporto di crescita e successiva risospensione in tampone fosfato salino addizionato al colorante Trypan Blue. A differenza delle cellule in necrosi/apoptosi, le cellule vitali non consentono l’ingresso del colorante al loro interno. La conta cellulare viene effettuata a diversi time-point di crescita delle cellule mediante valutazione al microscopio ottico invertito, così da ottenere una curva di crescita cellulare nel tempo.
TEST CALCEINA-AM/PROPIDIO-IODURO
Il test citofluorimetrico calceina-AM/propidio-ioduro è un’analisi a due colori che consente di valutare la vitalità delle cellule, basandosi sull’integrità della membrana plasmatica e sull’attività esterasica. Questo test distingue rapidamente le cellule vive da quelle morte tramite due marcatori: la calceina-AM, un colorante fluorescente verde che indica l’attività esterasica intracellulare, e il propidio ioduro, un colorante fluorescente rosso che evidenzia le cellule con membrane plasmatiche compromesse. Grazie alla valutazione di un numero elevato di cellule per campione, il test offre una discriminazione rapida e precisa tra campioni di controllo e quelli trattati con i composti in esame, a garantire solidità e affidabilità dei risultati.
In particolare, dopo uno step iniziale di lavaggio nel quale le cellule morte vengono rimosse, la soluzione di colorazione cristalvioletto viene aggiunta alle cellule e lasciata agire. Dopo un secondo step di lavaggio, il cristalvioletto viene solubilizzato con l’SDS e la sua assorbanza viene misurata ad una lunghezza d’onda di 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.È possibile effettuarla anche dopo trattamento delle cellule con composti da testare per analizzare il loro impatto sulla vitalità cellulare.
Test di citotossicità cellulare
COLORAZIONE CON CRISTAL VIOLETTO
Il test del cristal violetto è un metodo colorimetrico utilizzato per valutare la densità delle cellule aderenti in coltura. Si basa sulla capacità del colorante cristal violetto di legarsi a molecole contenenti il ribosio, incluso il DNA, fornendo una misura indiretta della quantità di cellule presenti. Questo saggio è rapido, economico e consente di monitorare la crescita cellulare o l’effetto di trattamenti citotossici. Un ulteriore vantaggio è la possibilità di analizzare più campioni in parallelo, rendendolo ideale per studi su larga scala.
La sua quantificazione avviene mediante misurazione spettrometrica dell’assorbanza a 492 nm a seguito della riduzione di un sale di tetrazolio di colore giallo, INT, mediante NADH in un colorante rosso della classe formazano solubile in acqua. La quantità di formazano è direttamente proporzionale alla quantità di LDH in coltura, a sua volta direttamente proporzionale al numero di cellule morte o danneggiate.
TEST DI RIDUZIONE DELL’MTT
Il test MTT è un saggio colorimetrico utilizzato per valutare la vitalità cellulare in base all’attività metabolica. Si basa sulla capacità delle cellule vive di ridurre il sale tetrazolio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) in formazano, un composto insolubile di colore viola. L’intensità del colore, misurata spettrofotometricamente, è proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive. La concentrazione della sostanza in esame necessaria per ridurre del 50% l’attività metabolica rispetto al controllo determina l’IC50. Viene calcolata interpolando i dati di assorbanza ottenuti a diverse concentrazioni della sostanza e utilizzando modelli di regressione, come la curva sigmoide dose-risposta. Questo parametro è fondamentale per valutare l’effetto di composti tossici o farmacologici. L’MTT è un metodo sensibile e affidabile per studiare la proliferazione o la tossicità cellulare.
Il Neutral Red è un colorante vitale che viene assorbito attivamente dalle cellule viventi e accumulato nei lisosomi. Questo test viene spesso utilizzato per valutare la vitalità cellulare e la tossicità.
Questo test fornisce informazioni sulla vitalità cellulare, poiché le cellule vitali assorbiranno e tratteranno il Neutral Red, mentre le cellule danneggiate o morte avranno una minore capacità di accumulo.
TEST DEL RILASCIO DI LDH
La lattico deidrogenasi (LDH) è un enzima citosolico stabile che viene rilasciato nel surnatante cellulare quando la membrana plasmatica viene danneggiata (es. apoptosi, necrosi o altre forme di danno cellulare). LDH viene misurata per valutare la presenza di un danno tissutale o cellulare dopo esposizione a composti potenzialmente citotossici. La sua quantificazione avviene mediante misurazione spettrometrica dell’assorbanza a seguito della riduzione di un sale di tetrazolio a formazano. Il saggio per il dosaggio della citotossicità dell’LDH è un metodo semplice e robusto per valutare gli effetti citotossici sulle cellule in coltura.
L’analisi dei campioni viene effettuata mediante citofluorimetro, rilevando il segnale dell’annessina V nella fluorescenza verde e quello del propidio ioduro nella fluorescenza rossa. L’apoptosi precoce si caratterizza per una colorazione positiva all’annessina V e negativa per il propidio ioduro, l’apoptosi tardiva per una colorazione positiva per entrambi, ed infine la necrosi per una colorazione negativa per l’annessina V e positiva per il propidio ioduro.
TEST DI CAPTAZIONE DEL ROSSO NEUTRO
Il test di captazione del rosso neutro è un saggio citotossicologico basato sulla capacità delle cellule vive di trattenere il colorante Neutral Red nei lisosomi. Le cellule vitali accumulano il colorante nei lisosomi intatti, mentre quelle danneggiate o morte perdono questa capacità, rilasciando il Neutral Red nel mezzo di coltura. La vitalità cellulare viene quindi valutata misurando l’assorbanza del colorante rilasciato. Questo consente di quantificare rapidamente e con precisione l’effetto citotossico di sostanze su un elevato numero di campioni, rendendo il test economico, sensibile e adatto a studi su larga scala.
L’assorbanza dei surnatanti viene valutata alla lunghezza d’onda di 540 nm mediante lettore di micropiastre. Si ottiene così la vitalità cellulare impostando la densità ottica delle cellule non trattate come 100% di vitalità e calcolando la vitalità dei campioni trattati come il rapporto, moltiplicato per 100, tra le densità ottiche delle cellule trattate e non trattate. È così possibile identificare l’IC50 di un determinato composto, ovvero la concentrazione di farmaco che induce il 50% di mortalità cellulare.
Test di proliferazione/apoptosi cellulare
Test Apoptosi
I test per la valutazione dell’apoptosi permettono di distinguere le cellule vitali, apoptotiche (in fase precoce o tardiva) e necrotiche, fornendo informazioni fondamentali sulla citotossicità di un composto. Uno dei metodi più efficaci è il test citofluorimetrico basato sulla doppia colorazione con Annexin V e ioduro di propidio (PI). Annexin V si lega alla fosfatidilserina esposta sulla membrana cellulare nelle fasi iniziali dell’apoptosi, mentre il PI identifica le cellule con membrane compromesse. Questo approccio consente una distinzione accurata delle diverse popolazioni cellulari, contribuendo alla valutazione della sicurezza e dell’efficacia dei composti da testare.
L’intensità di fluorescenza viene valutata mediante citofluorimetro, tenendo conto che le cellule che si preparano alla mitosi contengono livelli maggiori di DNA e pertanto mostrano un’aumentata flurescenza. Viene così calcolata la percentuale di cellule presente in ciascuna fase del ciclo cellulare.
Valutazione del contenuto di DNA e ciclo cellulare
L’analisi del ciclo cellulare, in risposta o meno al trattamento con composti da testare, viene effettuata mediante colorazione con propidio ioduro, così da determinare il quantitativo di cellule presente in ciascuna fase del ciclo cellulare sulla base delle variazioni del loro contenuto di DNA.
L’intensità di fluorescenza viene valutata mediante citofluorimetro, tenendo conto che le cellule che si preparano alla mitosi contengono livelli maggiori di DNA e pertanto mostrano un’aumentata flurescenza. Viene così calcolata la percentuale di cellule presente in ciascuna fase del ciclo cellulare.
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